Molecular genotyping and laboratory analysis of hemophilia A in west bank, Palestine

Other Title(s)

التنميط الجيني الجزيئي و التحليل المخبري للهيموفيليا (أ)‎ في الضفة الغربية-فلسطين

Dissertant

Hasan, Shadi Khalil Muhammad

Thesis advisor

Surur, Mahmud Abd al-Rahman

University

Birzeit University

Faculty

Faculty of Science

Department

Department Nutrition and Dietetics

University Country

Palestine (West Bank)

Degree

Master

Degree Date

2021

Arabic Abstract

خلفية البحث : الهيموفيليا (1) هو مرض نزف الدم المرتبط بالجنس الناتج عن نقص أو خلل في عامل التخثر الثامن وهذا العامل هو بروتين سكري في البلازما و يلعب دورا مهما في عملية تجلط الدم.

يصيب مرض الهيموفيليا واحد من كل 5000 من المواليد الذكور.

تم التعرف على أكثر من 1200 طفرة في جين العامل الثامن والتي ارتبطت في مرض الهيموفيليا (أ) تتنوع هذه الطفرات من استبدال النوكليوتيدات المفردة إلى عمليات الحذف / الإدراج و الانعكاس الإجمالي .

يمثل انعكاس انترون 22 وانعكاس انترون 10 حوالي 50-40 و 5-2% من حالات الهيموفيليا (أ) الحادة على التوالي .

الأهداف : هدفت هذه الدراسة إلى تحديد النمط الجيني لجين العامل الثامن وإجراء الفوصات المخبرية للهيموفيليا(أ) في الضفة الغربية، من أجل توفير التشخيص و العلاج المناسبين للمرضى .

طرق البحث: تمت دراسة ما مجموعه 79 حالة من حالات الهيموفيليا (أ) كان منهم 73 ذكور و 6 إناث من 49 عائلة مختلفة لا تجمعها قرابة تم إجراء فحوصات الدم وفحص التخثر لكل مريض وشملت تعداد الدم الكامل (CBC) ، وقت الترومبو بلاستين الجزئي (PT) ووقت الترومبو بلاستين الجزئي المنشط (APTT) تم إجراء قياس مستوى الدم من العامل الثامن (FVIII: C) باستخدام مقايسة التخثر على مرحلة واحدة تم تحضير الحمض النووي الجيني DNA عالي الوزن الجزيئي باستخدام طريقة التمليح تم إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل المتداخل (NLD-PCR للكشف عن الانعكاس الانترون 22 Inv22) لجميع حالات مرضى الهيموفيليا (أ) الحادة و كذلك الأمهات الحاملات للصفة الوراثية لمرض الهيموفيليا، بينما تم استخدام تفاعل البلمرة المتعدد (Multi-plex PCR) للكشف عن انعكاس انترون 1 (Inv1).

تم استخدام تسلسل الحمض النووي DNA Sequencing لتحليل الطفرات الجينية لجين العامل الثامن لمرضى الهيموفيليا (أ) ذوي الحالات المتوسطة والخفيفة وكذلك لأولئك الذين كانوا سلبيين لكل من inv22 و invl .

النتائج : اعتماداً على كل من مستويات الدم للعامل الثامن (FVIII:C) والتنميط الجيني لجين العامل الثامن، فقد تم تصنيف 54 (%74) حالة على انها من النوع الحاد بينما 9 حالات (12.3%) هي من النوع المتوسط وعشر حالات (13.7%) من النوع الخفيف.

تحليل inv22 بواسطة NLD-PCRأظهر أن 57.4% من مرضى ال (أ) هيموفيليا الحاد لديهم هذه الطفرة، بينما أظهر تحليل invl بواسطة تفاعل البلمرة المتعدد (Multiplex PCR أن مريضين كانا موجبين لـ invl بنسبة %3.7 بين جميع حالات الهيموفيليا من النوع الحاد.

تم فحص عينة واحدة بالكامل وتم تحديد الطفرة المسببة للمرض، وهي ( 388G.) التي تؤدي إلى استبدال الحمض الأميني الجلايسين في الكودون 130 بالأرجينين (Gly130Arg) في المنطقة A1 من بروتين العامل الثامن.

في 4 عينات أخرى، تم تحديد ثلاثة من الطفرات الغير مؤذية يتلقى حوالي 3.7% فقط من مرضى الهيموفيليا العلاج الوقائي البديل العامل التخثر الثامن ويتلقى الباقي 86.3% العلاج عند الطلب معظم مرضى الهيموفيليا 76.7.

ليس لديهم تاريخ عائلي للمرض بينما 23.3% لديهم تاريخ عائلي للمرض.

خاتمة نسبة وجود انعكاس الانترون 22 وانعكاس الانترون 1 للعامل الثامن في هذه الدراسة كان 57.4% و3.7% على التوالي في حالات الهيموفيليا من النوع الحاد 23.3% من مرضى الهيموفيليا ليس لديهم تاريخ عائلي للمرض وبالتالي فإن ظهور المرض لديهم يُعزى إلى طفرات جديدة.

هناك حاجة لاجراء المزيد من الفحوصات للحالات التي كانت سلبية ل invl inv22 عن طريق تسلسل الحمض النووي DNA sequencing للكشف عن الطفرات المسببة للمرض.

English Abstract

Background: Hemophilia A (HA) is a sex-linked bleeding disorder resulting from deficiency or dysfunction of coagulation FVIII, a plasma glycoprotein that plays an important role in the blood coagulation cascade.

HA occurs in one in every 5000 male births.

More than 1200 mutations have been identified in the F8 gene and associated with HA.

These mutations vary from single nucleotide substitution to gross deletions/insertions and inversions.

Intron 22 inversion and intron 1 inversion account for approximately 40–50% and 2- 5% of severe HA cases, respectively.

Objectives: Screening for the molecular defects has become a crucial tool in hemophilia care with respect to prediction of the clinical course and safe genetic counseling of relatives.

Therefore, the aim of the present study was to genotype the F8 gene and conduct a laboratory analysis of hemophilia A in the West Bank, in order to provide proper diagnosis and management of patients.

Methods: A total of 79 HA cases were enrolled (73 males and 6 females) from 49 unrelated families.

Hematological and coagulation screening tests were conducted for each patient including: Complete blood count (CBC), partial thromboplastin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT).

Coagulation FVIII activity assay (FVIII: C) was performed by using one-stage clotting assay.

High molecular weight genomic DNA was prepared using salting out method.

Nested Long Distance Polymerase Chain Reaction (NLDPCR) was performed for detection of F8 gene intron 22 inversion (Inv22) for all severe HA cases as well as carrier mothers, while multiplex PCR was used for detection of F8 gene intron 1 inversion (Inv1).

DNA sequencing was used to analyze F8 gene mutations for mild and moderate HA patients as well as for those who were negative for both inv22 and inv1.

Results: Depending on both FVIII activity levels and genotyping of F8 gene, 54 (74%) cases were grouped as severe, 9 (12.3%) cases as moderate and 10 (13.7%) of the study cases as mild hemophilia A.

Analysis of inv22 by NLD-PCR showed that 57.4% of severe HA patients have this inversion, while analysis of inv1 by multiplex PCR revealed that two patients were positive for inv1 with a percentage of 3.7% among all HA severe cases.

One sample has been completely screened and the disease-causing mutation has been identified, namely (c.388G>A) that result in substitution of the amino acid glycine at codon 130 by arginine (p.Gly130Arg) in A1 domain of FVIII protein.

In another 4 samples, so far 3 harmless SNPs were identified.

Only 3.7% HA patients receive prophylactic FVIII replacement therapy and the rest (86.3%) were on-demand treatment.

Most patients (76.7%) have a family history of HA and 23.3% have no family history of HA.

Conclusion: The frequency of F8 gene inv22 and inv1 were found in 57.4% and 3.7% among severe HA patients, respectively.

About 23.3 % of HA patients have no family history and thus the development of HA is attributed to de novo mutations.

Further investigation of HA cases by DNA sequencing is necessary to detect F8 gene mutations in cases that were negative for inv22 and inv1.

Main Subjects

Biology

No. of Pages

81

Table of Contents

• APA
• MLA
• AMA

Language

English

Data Type

Arab Theses

Record ID

BIM-1412358