Molecular characterization, genotyping and combination susceptibility testing for colistin, rifampin and fosfomycin of Acinetobacter baumannii

Other Title(s)

التوصيف الجزيئي و التنميط الجيني و الجمع في اختبارات الحساسية بين الكوليستين و الريفامبين و الفوسفوميسين على الأسينيتوباكتر بوماني

Dissertant

al-Khatib, Sana Ghalib

Thesis advisor

Farraj, Muhammad A.

University

Birzeit University

Faculty

Faculty of Science

University Country

Palestine (West Bank)

Degree

Master

Degree Date

2022

Arabic Abstract

تم جمع 29 عزلة سريرية من ال Acinetobacter baumannii من مجمع فلسطين الطبي في رام الله و مؤسسة المقاصد الخيرية في القدس.

كانت جميع العزلات مقاومة للعديد من الأدوية بما في ذلك مقاومتها الكاربايينيمات.

و قد تم تحديد أقل تركيز متبط (MIC) من المضادات الحيوية الكوليستين و الريفامبين و الفوسفوميسين لجميع العزلات.

بالإضافة إلى ذلك، تم فحص مزيج من كوليستين مع ريفامبين و مزيج من كوليستين مع فوسفوميسين لتحديد احتمال وجود تآزر بينهما.

علاوة على ذلك، فقد تم تقييم آلية مقاومة البكتيريا لمجموعة الكاربابينيمات بواسطة تفاعل البوليمير المتسلسل (polymerase chain reaction) لجينات بيتا لاکتام (carbapenemases) مصنفة في مجموعة أميلر A و B و C و D.

وقد تم اختيار الجينات التالية 23-blaspc-a، blamDM-1، blaox4 blaox4-24، laoxA-4s، blaoxA-51، blaos4-58 .

بخصوص تكوين البيوفيلم، فقد تم عمله على العزلات النامية في أنابيب و صبغها بالبنفسج الكريستالي و كذلك بالسفرانين وقد تم تحديد النميط الجيني لعزلات A baumanii بواسطة التضخيم العشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال بتفاعل البوليمير المتسلسRandom Amplified Polymorphic DNA-polymerase chain reaction (RAPD-PCR).

كان MIC للكوليستين ug/mL 2 - بنسبة 89.7 (29/26) في العزلات مما يثبت حساسيتها للكوليستين، و وجدنا ٣ عزلت كان MIC لها ng/ml 24 بنسبة 10.3 (29/3) أي انها مقاومة للكوليستين.

أظهر مزيج الكوليستين مع الريفامبين وجود تأزر في 5 عزلات حيث كان مؤشر التثبيط الجزئي ( Fractional Inhibitory Index) اقل من 0.5 0.5 - FIC)، اما بقية العزلات فكان التأثير في تقليل ال MIC بنسبة كبيرة مما يساعد في تخفيف الضغط الانتقائي و منع تطوير مقاومة من البكتيريا ضد الكوليستين.

أدى هذا التأثير التآزري إلى تقليل MICS للكوليستين بحيث ان MICA ng/ml أصبحت MIC=0.25 g/ml.

كذلك الأمر للريفامبين بحت كانت MIC-4 ug/ml أصبحت MIC<1 ug/ml،فتحولت العزلات المقاومة الى عزلات حساسة.

بالنسبة للفوسفومايسين، كانت ICs 64 ng/ml ولم تكن أي من العزلات حساسة له، لكن بعد دمجه مع الكوليستين أصبحت جميع العزلات ما عدا واحدة حساسة للفوسفوميسين ( MIC - 4 ng/ml).

كما كان تأثير الدمج فعالا اذ أدى الى تقليل تركيز MIC للكوليستين من ug/ml 4 قبل الدمج الى ug/ml 1.0 بعده و هذا تم رؤيته في واحدة من العزلات اذ انه قد يؤثر إيجابيا باستخدام المزيج للعلاج و منع تطور مقاومة البكتيريا للكوليستين.

حملت جميع العزلات السريرية الجينات 23-blast و 51-blaoxA بمعدل %100 و هذا قريب جدا من النسب المذكورة في الأدبيات،كما كان جين 48-blaoxa موجودًا في %93.1% من العزلات و هذه كانت أيضا نسبة قريبة جدا من الادبيات.

لكن لم تحمل أي من العزلات 24-blast و blaoxa-ss في هذا البحث، و كذلك كانت نسب حمل هذين الجينين منخفضة في الأدبيات.

و حملت العزلات المفحوصة جينات 1-blaa و blaspca بمعدلات عالية في بحثنا، و لكن بمعدلات منخفضة في الأدبيات.

لقد توصلنا ان جين 23-blaox4 هو الجين السائد في العزلات المفحوصة لدينا متبوعا بجين blaoxas من تم جين 1 -blast و أخيرا جين 2-blakpc 2-blaspC كانت نسبة البيوفيلم فيها 63.2% (19/12).

تم وضع نتائج RAPD-PCR في 9 فئات مختلفة بناءً على حجم و عدد الحزم الناتجة (النطاقات).

معظم العزلات صنفت في المجموعة الأولى بنسبة 58.6% (17/29) و كان 58.8% منها ماخوذ من مرضى العناية المكثفة، اما بقية العزلات فقد وزعت على بقية المجموعات وكان عند الحزم يتراوح من 2 الى 5 حزم.

كانت نسبة الحزمة ال bp 1500 موجودة بأعلى نسبة (28/29) %96.6، تبعتها حزمة ال bp2500 وحزمة bp 1000 بنسبة 93.1 (27/29) لكل منهما وحزمة ال 600bp بنسبة 75.9% (22/29)،ووضعت بقية العزلات (650 and 250 bp ، 500، 400 في المجموعات الأخرى بنسب تتراوح من 3.4% الى 6.9% .

لدراسة حمل البكتيريا لبعض جينات البيتا لاكتام و علاقتهم بمقاومتها للكاربايينيمات، فقد أظهرت النتائج وجود جين 23-blaost4 بنسبة 100% و جين 48-blasa بنسبة 93.1، و جين 1-blast بنسبة 79.3، وجين 2-blaspc بنسبة 48.3.

بالنسبة للبيوفيلم فقد كانت نسبة تكوينه من عزلات A baumannii هي 65.5 و قد كان متيرا للاهتمام ان جميع العزلات التي كونت البيوفيلم كانت تحمل جين 1- blaDM بمعدل 100 (19/19) و التي كانت تحمل جين في الختام، A baumannii من الجراثيم الشديدة العدوى و التي تسبب العديد من الالتهابات في جسم الانسان و تودي بحياة الكثير من المرضى من كبار السن و ذوي نقص المناعة المكتسبة و غيرهم من المقيمين في غرف العناية المكثفة، و خوفا من نشوء جراثيم مقاومة للكوليستين المضاد الحيوي الأخير لعلاج هذه الجرثومة فمن المفضل عدم استعماله لوحده بل مع مضادات حيوية أخرى مثل ريفاميين و فوسفومايسين حيث أظهرت نتائج هذه الدراسة نجاح استعمال هذه المضادات معا.

English Abstract

A total of 29 clinical isolates of Acinetobacter baumannii were collected from Palestine Medical Complex in Ramallah and Al-Makassed Charitable Foundation in Jerusalem.

All the isolates were multidrug resistant including resistance to carbapenems.

The minimal inhibitory concentration (MIC) for all isolates was determined for colistin, rifampin and fosfomycin.

In addition, combination of colistin-rifampin and colistin-fosfomycin were tested using the checkerboard method to determine the possible presence of synergy.

Furthermore, the mechanism of resistance for carbapenems was evaluated by Polymerase Chain Reaction (PCR).

Genes encoding for beta lactamases (carbapenemases) from Ambler group A, B, C, and D were selected and tested by PCR.

The following beta lactamase genes were tested; blaKPC-2 (group A), blaNDM-1 (group B), and b/aOXA-23, b/aOXA-24, blaOXA-48, b/aOXA-51, and blaOXA-58 (Group D).

Biofilm formation was also determined after growing the isolates in tubes and stained with crystal violet and confirmed by repeating the experiment and staining with safranine.

The epidemiologic genotyping of the A.

baumannii isolates was determined by the Random Amplified Polymorphic DNA polymerase chain reaction (RAPD-PCR) fingerprinting method.

The MIC for colistin was < 2 ug/mL in 89.7% (26/29) indicating that these isolates were susceptible to colistin.

However, an MIC of >4 ug/mL was found in 10.3% of the isolates (3/29).

The combination of colistin-rifampin showed the presence of synergy in 5 isolates where the Fractional Inhibitory Index (FIC) for the combination was <0.5, other isolates showed additive effect that could help relief the selective pressure and prevent the evolution of colistin resistance.

This synergistic effect has resulted in the reduction of the MICs of colistin (MIC>4 became 0.25) and rifampin (MIC>4 became <1) when combined with each other’s where resistant isolates turned to sensitive.

As for fosfomycin, the MICs were >64 ug/mL and none of the isolates tested were susceptible to fosfomycin.

However, the MIC results showed that most of isolates became fosfomycin susceptible with an MIC of <4 ug/ml after combination with colistin (MIC >64 became <4).

There was one isolate only that remained resistant to fosfomycin after combination with colistin at MIC >64.

It is also interesting to note that the MIC result showed that one of the isolate that was colistin resistance (MIC=32ug/ml) became sensitive to colistin when combined with fosfomycin (MIC was reduced to 1 ug/ml).

There was no synergy detected in colistin -fosfomycin combination.

However, the effect was additive (FIC is 0.5-4).

Since the MICs for fosfomycin were significantly lowered, it may be useful to use it in combination with colistin to treat infections caused by A.

baumannii which may prevent evolution of resistance to colistin due to selective pressure.

The mechanisms of carbapenem resistance in A.

baumannii are the acquisition of Class D beta lactamases OXa-23, OXA51 and OXa-48, followed by Class B metallo beta lactamase NDM-1 then Class A KPC-2.

All of the clinical isolates carried the genes that encoded for OXA-23 and OXA-51 at rate of 100% and this is too close to literature.

OXA-48 was present in 93.1% of the isolates, a finding that is also very close to that reported in literature.

However, OXA-24 and OX-58 were not found in our research, but was found in low rates in literature.

NDM-1 and KPC-2 was found in high rates in our research (79.3% and 48.3%), but in low rates in literature.

We found out that OXA-23 is the most prominent OXA-type in our study, followed by OXA-48, NDM-1 and KPC-2, respectively.

Biofilm was formed by 65.5% of the A.

baumannii isolates tested.

It was interesting to note that all A.

baumannii isolates that formed a biofilm are positive for blaNDM-1 and most of them has the blaKPC-2 gene .In the absence of blaNDM-1 , no biofilm was formed where the presence of blaNDM-1 gene in isolates that formed biofilm has a rate of 100% (19/19) .The presence of blaKPC-2 gene in isolates that formed biofilm has a rate of 63.2% (12/19).

Biofilm formation could be correlated with the presence of blaNDM-1.

The results of the RAPD-PCR were put in 9 different classes based on the size and number of these bands.

Most of the isolates (58.6%, 17/29) were located in one main classe (I), the remaining isolates were placed in separate classes.

It is of interest to note that 58.8% (10/17) of the isolates in class I pattern came from the intensive care unit (ICU).

Our data showed that four main bands of 2500, 1500, 1000 and 600 were observed in the gel, only 5 isolates had one different band than these mentioned above (650, 500, 400,250 bp).

The band of 2500 bp and 1000 bp have been seen in 93.1% (27/29) of the isolates, the band of 1500 bp has the highest rate of 96.6% (28/29) among the isolates and the band of 600 bp has a rate of 75.9% (22/29).

The band of 500bp has a rate of 6.9% (2/29) while bands 400, 650 and 250 bp each has a rate of 3.4% (1/29).

In conclusion, A.

baumannii is an organism that causes many infections and claims the lives of many patients.

It has evolved to become multidrug resistant and can only be treated with colistin.

The emergence of colistin resistant isolates has been observed in this research and reported in literature.

It is of utmost importance to implement measures to prevent the emergence of colistin resistance in this pathogen.

We recommend based on our finding to use combination therapy such as rifampin which proved to be synergistic when combined with colistin.

Combination with fosfomycin is also recommended where reduction in MIC was observed.

Main Subjects

Natural & Life Sciences (Multidisciplinary)

No. of Pages

128

Table of Contents

• APA
• MLA
• AMA

Language

English

Data Type

Arab Theses

Record ID

BIM-1429291