Purification and characterization of marine bacillus thuringiensis N2 urease

Abstract AR

نظرا للتقدم العلمي الواضح في استخدام الكائنات الدقيقة لإنتاج العديد من المواد التي كانت تصنع بطرق صناعية باهظة التكلفة إلى إنتاجها بالطرق الحيوية باستخدام الكائنات الدقيقة مما فتح أبوابا أكثر أمانا للبيئة و سهولة الحصول على هذه المواد إضافة إلى تكلفتها الأقل، و نظرا للأهمية الاقتصادية لإنزيم اليورياز من الناحية الطبية و الزراعية و الصناعية، فإنه ينتج بطريقة صناعية باهظة التكاليف و مع التقدم العلمي اهتم العلماء بإنتاج هذا الإنزيم من الكائنات الدقيقة باستخدام تقنية حيوية حديثة.

لذا اهتمت الدراسة الحالية بإنتاج الأنزيم تحت الاختبار من بكتيرية بحرية المصدر هي باسيلس ثيورينجينسيس ن.

مع تنقية الأنزيم المنتج و دراسة بعض خواصه و أسفرت الدراسة على النتائج التالية : 1.

معالجة محلول الأنزيم بمحلول 55 % أسيتون و ذلك عند درجة حرارة 4°م و لمدة دقيقتين و بعد ع الطرد المركزي وجد أن نشاط الأنزيم قد تركز في الراسب و عند قياس المحتوى البروتيني و كذلك النشاط النوعي للإنزيم وجد أنه زاد بمعدل 9.8 ضعف، و أن محتوى البروتين نقص بمعدل 92.3 %.

2.

تم عمل فرز غشائي ضد محلول الفوسفات المنظم (ذو تركيز 0.2 مول عند رقم هيدروجيني قدرة 7.5) درجة حرارة 4°م، ثم تمت معاملة المحلول بواسطة كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني (DEAE-Sephadex A50) مع إزاحة العمود بواسطة محلول الفوسفات المنظم (ذو تركيز 0.2 مول و رقم هيدروجيني قدرة 7.5) مع تدرج تركيزي لمحلول كلوريد الصوديوم.

و عند اختبار الأجزاء المزاحة عند 280 نانومتر لمعرفة تركيز البروتين مع قياس نشاط الأنزيم في كل جزء وجد احتواء الأجزاء على حزمة واحدة تظهر نشاط الأنزيم تحت الاختبار.

و بعد تجمع هذه الأجزاء وجد احتواء الأجزاء على حزمة واحدة تظهر نشاط الأنزيم تحت الاختبار.

و بعد تجمع هذه الأجزاء وجد أن محتوى البروتين نقص بمعدل 98.1 % و أن النشاط النوعي للأنزيم قد زاد بمعدل 31.81 ضعف.

3.

و قد تم تكرار عملية الفرز الغشائي للمحلول الناتج من الكروماتوغرافي الأنيوني (DEAE-Sephadex A50) ضد محلول الفوسفات المنظم (ذو تركيز 0.2 مول و رقم هيدروجيني قدره 7.5) ثم معالجته بواسطة عمود الترشيح (Sephadex G-120-200) و بنفس طريقة الإزاحة في العمود الأول، وقد وجد أن الأجزاء المزاحة من المرشح الأخير تحتوي على حزمة واحدة تظهر نشاط الأنزيم تحت الاختبار و وجد أن المحتوى البروتيني قد نقص بمعدل 99.4 % و النشاط النوعي للأنزيم قد زاد بمعدل 95.27 ضعف.

4.

بعد تركيز الأجزاء التي تحتوي على نشاط الإنزيم تم اختبارها بواسطة طرق التهجير الكهربي وجد أنه عند استخدام (SDS / PAGE) الفصل الكهربي لمعرفة الوزن الجزيئي لجزيئات البروتين وجد أن وزنه الجزيئي 97.4 ك دالتون.

5.

عند دراسة ديناميكية الأنزيم و العوامل التي تؤثر على نشاطه : وجد أن نشاط الأنزيم يعتمد على تركيز المادة الخاضعة لفعل الأنزيم حيث لوحظ أن نشاط الأنزيم يزداد بزيادة تركيز مادة التفاعل و عند دراسة هذه العلاقة بواسطة طريقة لينويفر-بروك وجد أن Km تساوي 2.94 مليمول و أن V max تساوي 25 ميكرومول / ملليلتر / دقيقة.

و عند دراسة تأثير درجة الحرارة المثلى لنشاط الأنزيم وجد أنها 25°م و عند دراسة تأثير مدى تحمل الأنزيم للحرارة وجد أنه قادر على تحمل درجة حرارة حتى 50°م و اتضح من الدراسة أن الأس الهيدروجيني الأمثل هو (8-8.5)، و قد وجد أن زمن التحضين الأمثل هو 15 دقيقة من بداية التفاعل.

إضافة إلى دراسة تأثير كاتيونات بعض فلزات الأملاح المختلفة و وجد أن أيون النحاسيك أعطى زيادة في نشاط الأنزيم عن أيونات الأملاح الأخرى.

6.

و بدراسة محتوى البروتين من الأحماض الأمينية في الأنزيم النقي وجد أنه غني في محتواه من الأحماض الأمينية (3-ميثايل هستيدين، سيستين، تريبتوفان)، و فقر محتواه من الأحماض الأمينية (الجليسين و ألينين و بيتا-ألينين).